DFG1

Die Rolle von NFAT2 für die Sensitivität von Tumorzellen für NK-Zell-vermittelte antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität

01.05.2022 bis 30.04.2025

Die Einführung monoklonaler Antikörper (mAbs) hat die Behandlung von Tumorpatienten erheblich verbessert. Die ersten verfügbaren Antitumor-mAbs Rituximab (anti-CD20) und Trastuzumab (anti-Her2/neu) sind zu einer tragenden Säule der Therapie bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) bzw. Her2-positivem (Her2+) Mammakarzinom (M-Ca) geworden. Dennoch hat der Erfolg von mAbs seine Grenzen: viele Patienten sprechen nicht darauf an, andere nur für eine begrenzte Zeit. In Vorarbeiten für das geplante Projekt konnten wir den Transkriptionsfaktor NFAT2 als wesentlichen Faktor der Resistenzvermittlung gegen antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC), einen Hauptwirkmechanismus therapeutischer mAbs, identifizieren. Dies erweitert unsere früheren Ergebnisse, dass der Verlust von NFAT2 mit der Transformation einer indolenten CLL zum aggressiven Richter-Syndrom assoziiert ist. Bei Her2+-M-Ca wurde eine Assoziation von niedriger NFAT2 Expression mit einer Reduktion des Gesamtüberlebens berichtet. Zusammen unterstreicht dies die Bedeutung von NFAT2 in der Pathophysiologie/Therapieresistenz sowohl der CLL als auch des M-Ca.
Im geplanten Projekt sollen die Mechanismen der NFAT2-vermittelten ADCC Resistenz bei CLL und Her2+ M-Ca aufgeklärt werden. Dazu wurde ein lentivirales CRISPR/Cas9-basiertes Modellsystem zur Deletion von NFAT2 in CLL- und Her2+-M-Ca-Zelllinien und primären malignen Zellen etabliert. Mit diesen generierten knockout Zellen sollen in vitro Zytotoxizitätsanalysen durchgeführt werden, um die Relevanz von NFAT2 zu erarbeiten. Diese sollen mit PBMCs von CLL-Patienten, dem Leukämie Eµ-TCL1-Mausmodell und patient-derived Organoiden aus Her2+-M-Ca-Patientinnen validiert werden. Da Perforine/Granzyme zentrale Effektormoleküle der ADCC darstellen, die beim Menschen hauptsächlich durch NK-Zellen vermittelt wird, sollen nachfolgend die Porenbildung durch Perforin, die Granzym-induzierte Apoptose und die Endozytose beider Effektormoleküle mittels Immunfluoreszenz, FACS und Proteomik analysiert werden. Kandidatengene, welche den Einfluss von NFAT2 vermitteln, werden durch eine vorgeschaltete RNA-Seq-Analyse identifiziert, was die Generierung von shRNA-Bibliotheken für ein RNAi-Screening ermöglicht. Entsprechende Kandidatengene werden mittels einzelner shRNA-Knockdowns validiert, um potenzielle Zielgene für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien zu identifizieren. Die physiologische Relevanz der Kandidatengene wird in vivo mittels Leukämie Xenotransplantat-Modellen, in welchen eine Therapie mit Rituximab angewandt wird, charakterisiert, wobei Effekte mittels optischer Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) und FACS Analysen erfasst werden. Zusammengefasst soll somit die Rolle von NFAT2 bei der Resistenz gegen therapeutische Antikörper bei der CLL und dem Her2+ M-Ca aufgeklärt werden, was in Zukunft dazu dienen könnte, die Effektivität immuntherapeutischer Ansätze zu optimieren.