CRISPR/Enhanced-Deletion Cas9-vermittelte, allel-spezifische Disruption des Rhodopsin-Gens: ein neuartiger, mutationsunabhängiger Ansatz zur Behandlung von RHO-gekoppelter autosomal dominant vererbter Retinitis pigmentosa

01.04.2022 bis 31.03.2025

Etwa 10–30% der Fälle von autosomal-dominanter Retinitis pigmentosa (adRP) werden durch Mutationen im Rhodopsin (RHO)-Gen verursacht, welches für das Sehpigment in Stäbchen-Photorezeptoren kodiert. Mehr als 150 verschiedene dominant wirkende RHO-Mutationen wurden funktionell charakterisiert, und es konnte gezeigt werden, dass ein dominant-negativer Effekt oder ein Funktionsgewinn des mutanten Rhodopsins ursächlich ist. Daher ist
das Abschalten oder die Disruption der mutierten Genkopie ein rationaler und erfolgversprechender Therapieansatz bei adRPPatienten mit RHO-Mutation. CRISPR/Cas9-basiertes Genome Editing bietet hier einen potenten Ansatz, um dauerhafte therapeutische Modifikationen auf DNA-Ebene zu erzeugen, wodurch verschiedene Probleme konventioneller Gentherapie (wie z.B. Toxizität bei Überexpression oder Fehlexpression) umgangen werden. Andere genetische Therapieansätze, einschließlich Antisense Oligonukleotid-basierter und CRISPR/Cas9-basierter Technologien, konzentrieren sich auf das selektive Abschalten bzw. die Disruption bestimmter mutierter Allele und adressieren damit nur ungenügend die Vielzahl verschiedener RHO-Mutationen bei den betroffenen Patienten. Dieses Projekt verfolgt einen neuartigen alternativen Ansatz - SEDIMS-X (selective disruption of the mutant allele through targeting common SNPs by Cas9-exo) – welcher das Potenzial hat, vorhandene Probleme und Beschränkungen auszuräumen. SEDIMSX wendet die CRISPR/Cas9-Technologie an, um mutierte Genkopien
selektiv zu inaktivieren, wobei der Ansatz dabei auf häufige, in Phase vorliegende Genvarianten und nicht die einzelne, krankheitsverursachende Mutation abzielt. SEDIMS-X verwendet neuartige Cas9-Exonuklease Fusionsproteine, die in der Lage sind, den Cas9-induzierten Strangbruch zu erweitern, so dass eine effektive Disruption der mutierten Genkopie erfolgt. Aufbauend auf erfolgreichen Vorergebnissen untersucht dieses Projekt eingehend die Anwendbarkeit und Nutzung von SEDIMS-X zur selektiven Disruption adRP-gekoppelte RHO-Mutationen in Hinblick auf eine klinische Anwendung. Zu diesem Zweck verfolgt das Projekt einen stringenten Workflow, um effektive Cas9-exo/gRNA Kombinationen mittels eines zellbasierten Reportersystems zu entwickeln und zu selektieren, deren Spezifität für die Zielvariante in menschlichen Fibroblasten zu validieren und zuletzt die therapeutische Wirksamkeit auf Transkript- und Proteinebene in einem stammzell-basierten Krankheitsmodell zu prüfen. Darüber hinaus sollen potenzielle Nebenwirkungen dieses neuartigen Ansatzes sorgfältig untersucht
und bewerten werden. Wir erwarten, dass SEDIMS-X das bestehende Repertoire an präklinischen, experimentellen Therapiestrategien für Patienten mit RHO-gekoppelter adRP erweitern und ergänzen wird.