Kartierung der Interaktome von lokalisierten mRNAs mittels Umgebung-Biotinylierung

01.05.2019 bis 30.04.2022

Funktion und Verhalten von lokalisierten mRNAs werden durch RNA-Bindungsproteine (RBPs) gesteuert, die zusammen mit der RNA Ribonukleoproteinpartikel (mRNPs) bilden. Die Bestimmung des Proteoms eines spezifischen mRNPs in vivo ist immer noch eine Herausforderung. Mit der RNA-Proximationsbiotinylierung (RNA-BioID) haben wir eine neue Methode entwickelt, um das Interaktom von mRNAs in vivo zu untersuchen. Bei RNA-BioID bindet eine modifizierte Biotin-Ligase an eine MS2-markierte RNA, biotinyliert die mit der RNA assoziierten Proteine und ermöglicht so deren affinitätsbasierte Reinigung. Wir haben die Anwendbarkeit von RNA-BioID demonstriert, indem wir das dynamische Proteom des beta-Aktins mRNP in embryonalen Fibroblasten (MEFs) von Mäusen identifiziert. Dieses mRNP enthält > 60 assoziierte RBPs, einschließlich aller sechs bisher bekannten Interaktoren. In der zweiten Förderperiode werden wir drei Schlüsselfragen hinsichtlich transportkompetenter mRNPs angehen. Zunächst werden wir eine Funktionsanalyse neuer beta-Actin-Interaktoren durchführen und ihren Rolle bei der zur lokalen Translation von beta-Actin analysieren. Zweitens werden wir das Interaktom von beta-Actin mRNA in differenzierenden Neuronen charakterisieren und mit dem Interaktom in MEFs vergleichen, um Änderungen in RNA-assoziierten Proteinen eines lokalisierenden mRNPs zu kartieren. Drittens wollen wir das Interaktom einer zusätzlichen lokalisierten mRNA in MEFs (arp2) mit dem der beta-Actin mRNA vergleichen. Die Interaktomkartierung von mRNPs in kultivierten Zellen wird die dynamischen Wechselwirkungen von Proteinen und mRNAs während ihres Lokalisierungsprozesses darstellen.