Biogenesis of multispan proteins of the mitochondrial outer membrane

01.03.2018 bis 28.02.2021

Für die Biogenese der mitochondriale Außenmembran (MAM) müssen neu synthetisierte Proteine zum Organell dirigiert und in die Lipiddoppelschicht eingebettet werden. Eine wichtige Familie der MAM Proteine, die sogenannten „multispan“ Proteine, weist mehrere α-helikale Transmembrandomänen auf. Das Hauptziel des vorliegenden Forschungsvorhabens ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die bei der Assemblierung von multispan Proteinen zugrunde liegen. Wir beabsichtigen folgende Fragen zu beantworten: 1) Wie bewerkstelligen die „Proteininsertionsfaktoren“ Mim1 und Mim2 den Einbau der MAM multispan Proteine? 2) Wie erfolgt die Unterscheidung zwischen MAM multispan Proteinen und den sogenannten Carrier-Proteinen, die in die mitochondriale Innenmembran eingebaut werden, auf der Ebene des Importrezeptors Tom70? und 3) Gibt es ein funktionell homologes System zu dem - ausschliesslich in Pilzen vorkommenden - MIM Komplex?
Wir werden in vitro, in organello und in vivo den Import von Modellproteinen in Mitochondrien, die aus verschiedenen Hefestämmen isoliert werden, analysieren. Ferner, um Frage 1 zu beantworten, werden wir Mim1 und Mim2 mittels eines zellfreien Systems synthetisieren. Die Art und Weise, wie die durch Detergenzien löslich gehaltenen Mim-Proteine ihre Substrate erkennen, wird untersucht. Zusätzlich werden beide Proteine in Lipidvesikeln rekonstituiert. Substratproteine sollen verwendet werden, um die korrekte und funktionelle Rekonstitution in Proteoliposomen nachzuweisen und zu zeigen, dass der MIM Komplex als minimale Einheit einer Integrase fungiert. Frage 2 wird adressiert indem, mittels „cross-linking“ Reaktionen, Regionen in MAM oder Carrier Substraten, sowie in Tom70 selbst, identifiziert werden, die für Rezeptor-Substrat-Wechselwirkungen essentiell sind. Dazu werden photo-aktivierbare Aminosäuren in die Proteine eingebaut. Die entstehenden Addukte werden mittels Western Blot und Massenspektrometrie identifiziert. Das Schicksal des Rezeptors Tom70, nach Bindung an Substrate, soll untersucht werden. Von Interesse ist vor allem, ob die Interaktion von Tom70 mit den restlichen Untereinheiten des TOM Komplexes oder mit dem MIM Komplex von der Art des gebundenen Substrates beeinflusst wird. Dies soll mit „cross-linking“ und/oder „pull-down“ Experimenten analysiert werden. Zu guter Letzt (Frage 3) sollen funktionelle Homologe von Mim1/2 in höheren Eukaryoten identifiziert werden. Ein Stamm (mim1Δ/mim2Δ), der einen Wachstumsdefekt aufweist, wird mit Expressionsplasmiden, die cDNA aus Maus oder Ratte enthalten, transformiert. Es werden die Gene identifiziert, deren Expression (der entsprechenden cDNA) zu einer Verringerung des Wachstumsdefektes führen. Die Funktion der identifizierten Kandidaten wird in Hefe und Säugerzellen verifiziert und eingehender analysiert. Zusammenfassend wird unser Forschungsvorhaben maßgeblich dazu beitragen, die grundlegenden Vorgänge der Biogenese mitochondrialer Außenmembranproteine zu verstehen.