Visualisierung und Massenmessung der Mikrotubuli-Depolymerisation durch Kinesin-8 mittels Massen-Photometrie

01.03.2024 bis 28.02.2027

Mikrotubuli sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts und spielen eine Schlüsselrolle bei der Zellteilung und -bewegung. Obwohl sie intrinsisch hochdynamische Strukturen sind, wird ihre Länge auch von anderen Regulatoren wie den Motorproteinen der Kinesin-8- und -13-Familie kontrolliert. Da die Regulierung der Mikrotubulilänge für die Mitose wichtig ist, werden diese Motoren mit Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht. Depolymerisierende Kinesine interagieren mit dem Mikrotubuli-Ende, um dieses zu verkürzen. Während ihre Bewegung zum Mikrotubuli-Ende weitgehend verstanden ist, ist unklar, wie ihr Hydrolysezyklus mit der Entfernung von Tubulin verbunden ist und wie viele Tubulindimere pro Kinesine entfernt werden. Wir werden ein neuartiges Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) entwickeln, um (i) einzelne Kinesine markierungsfrei zu verfolgen und (ii) gleichzeitig die Masseentfernung am Mikrotubuli-Ende während der Depolymerisation zu messen. Das Hefe Kinesin-8, Kip3, wird als Modellsystem für Mikrotubuli-Depolymerasen in rekonstituierten in-vitro-Assays dienen. Unser IRM ermöglicht die Abbildung einzelner Proteine durch die Interferenz von Licht, das von dem Protein und der Oberfläche des Probe gestreut wird. Ein rollendes differentielles Mittelungsverfahren ermöglicht es den ratiometrischen Kontrast zu bestimmen. Da dieser Kontrast direkt proportional zur Molekülmasse des Proteins ist, kann es auch als Massenphotometer genutzt werden. Zusätzlich erlaubt die Schwerpunkt-Messung eine präzise Einzelmolekül-Lokalisierung im Nanometerbereich. Vorläufige Messungen an einem IRM-Massenphotometer Prototypen zeigen die Fähigkeit, die Masse einzelner Tubulin- und Kip3-Monomere zu erfassen. Auf einem kommerziellen Massenphotometer könnte die Mikrotubuli-Depolymerisation durch Kip3 gemessen werden, wobei die Messzeit durch Fotodamage limitierend war. Weitere Herausforderungen sind der signifikante Unterschied in der Molekülmasse zwischen Kinesinen, Tubulinen und Mikrotubuli sowie die Oberflächenabstandsabhängigkeit des ratiometrischen Kontrasts. Um diese zu lösen, werden wir ein neues IRM-Massenphotometer entwickeln und optimieren und dieses mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) kombinieren. Die Optimierung wird durch rechnerische Ansätze zur Verbesserung von Kontrast, Partikelerkennung und Berücksichtigung des Oberflächenabstands ergänzt. Mit dem optimierten Mikroskop werden wir in der Lage sein, nicht markierte Motoren auf Mikrotubuli zu verfolgen und Massenentfernungen bis zu einer Molekülmasse von 10 kDa mit etwa 100-1000-mal weniger Licht im Vergleich zum kommerziellen System zu messen. Durch die Auflösung der Interaktion einzelner Kip3-Motoren mit Mikrotubuli und die Messung der Anzahl entfernter Tubuline werden wir neue Einblicke in den Depolymerisationsmechanismus gewinnen. Langfristig hoffen wir, dass unsere Arbeit an Mikrotubuli-Depolymerasen für die Krebsforschung von Nutzen sein wird.